中国公共卫生2006年4月第22卷第4期　　ChinJPublicHealthApr2006Vol.22No.

4文章编号:100120580(2006)0420429202　　中图分类号:R373133　　文献标识码:A

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【论　　著】

登革2型病毒全长基因组的长链RT-PCR法扩增3

贡树基,赵卫,曹虹,张文炳,周浩,陈丽丹

　　摘　要:目的　采用长链RT-PCR技术扩增登革2型病毒新几内亚株(NGC)全长基因组。方法　根据登革2

型病毒NGC株基因组全序列设计引物,在上游引物中加入Sp6RNA聚合酶启动子核心序列,下游引物中加入ClaⅠ内切酶位点。从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA,采用长链RT-PCR技术进行扩增。以获得的PCR产物为模板分别扩增3个NGC株特异的基因片段。结果　长链RT-PCR法扩增出约11kb基因片段,经PCR法证实为登革2型病毒NGC株特异序列。结论　通过长链RT-PCR技术,获得了登革2型病毒NGC株全长基因组性克隆打下基础。

关键词:登革2型病毒;全长cDNA;长链RT-PCR

Amplificationofcompletegenomeofdengue2virusbylongRT-Shuji,,CAOHong,etal.De2partmentofMicrobiology,SchoolofPublicHealth,MedicalUniversity(Guangzhou

510515,China)

Abstract:Objective　ToPCRforamplificationofthecompletegenomeofdengue2virus.accordingtothepublishednucleotidesequenceofDEN2NGCstrain.Sp6wastorestrictionendonucleasesiteforClaⅠwasaddedto3’terminal.AftervirusRNAwasex2tractedfromoftheinfectednew-bornmice,thecompletegenomeofDEN2NGCstrainswasamplifiedbythelongRT-PCR.ofspecificlengthswerere-amplifiedfromPCRproductsforidentification.Results　The11kbfull-lengthgenomeofdengue2viruswasamplifiedsuccessfullybythelongRT-PCR.Conclusion　Thecompletegenomeofdengue2viruswassuccessfultobeamplifiedusingthelongRT-PCR,anditwillbeadvantageousforfurtherconstructinginfectiousclone.

Keywords:dengue2virus;full-lengthcDNA;longRT-PCR

　　登革病毒(DengueVirus,DEN)属黄病毒科黄病毒属,基因组为单股正链RNA,全长约11kb,包括5’和3’非编码区及一个开放阅读框,共有4个血清型,均可引起登革热(DF)、登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)。通常登革2型病毒(DEN2)的感染较其他血清型更为严重〔1～6〕。本研究利用分子生物学技术扩增DEN2NGC株全长基因组,以进一步构建登革2型病毒感染性克隆。

1　材料与方法

111　病毒RNA制备　DEN2NGC株经乳鼠脑内接种传代

μmol/LdNTPs,最后加焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水至总体积30μl,55℃保温3h进行反转录,反应完毕,70℃灭活15

min。逆转录产物中加入1μl重组RNaseH,37℃温育20min,去除cDNA中混合的RNA。

…… 此处隐藏629字 ……

211　长链RT-PCR扩增结果(图1)　以提取的总RNA为

μmol/L反向引物,95℃作用3min,随后置冰浴中1min,再加入5μl5×buffer、1μl二硫代苏糖醇(DTT)、1μlRNA抑制剂、2μlSuperScriptⅢ逆转录酶(美国Invitrogen公司)、1μl10

3基金项目:广州市科技攻关计划重点项目(2004Z2-E0214)　作者单位:南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系,广

州510515

　作者简介:贡树基(1978-),男,河北衡水人,硕士在读,主要从事

登革病毒防治研究。

　通讯作者:曹虹

模板,应用长链RT-PCR方法扩增获得约11kbDNA片段,