磁珠羧基含量对灵敏度影响

一、磁性纳米颗粒的氨基化

SiO2/(PMMA/Fe3O4)磁性纳米颗粒进行修饰，首先，将15 mg（22.5 mg/mL）667 μL SiO2/(PMMA/Fe3O4)纳米颗粒磁分离，加入3 mL乙醇/水（2.985/0.015）混合溶液中，为了更好的分散Fe3O4颗粒，需将该溶液进一步超声10 min。然后，将6 μL APTS滴加到以上混合溶液中，并在室温（25 ℃）下振荡搅拌7小时（用塑料管做）。最后，利用外加磁场将APTS修饰的磁性颗粒从反应介质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗5次，磁分离。再用3 mL DMF（二甲基甲酰胺）清洗5次，最后以的5 mg/mL的浓度分散在DMF（3000 μL）中，待用。 二、羧基化磁珠的制备（粒径400nm）共2400 μL

取氨基化SiO2/(PMMA/Fe3O4)纳米颗粒的DMF溶液600 μL (5 mg/mL)分别逐滴的加入到600 μL含丁二酸酐(Succinic anhydride，SA)，0.00001，0.0001，0.001，0.01和0.1 mol/L的DMF中，20℃下，反应24 h后，用水洗涤数次后磁分离，加ddH2O (300μL)定容至10 mg/mL。 三、磁珠羧基含量影响效果测定

测定各浓度SA修饰磁珠的吸光值，并将其同时放在磁场中磁分离20分钟后测定相应的吸光值，计算比率。

四、磁珠的封闭（磁珠上含有羧基和氨基，氨基带正点，可吸附探针造成影响） 八只小管（每管150 μL）分成两组：

一组（编号1，2，3，4）：SA分别为0.0001，0.001，0.01，0.1 mol/L，不做任何处理。

二组（编号5，6，7，8）：SA浓度分别为0.0001，0.001，0.01，0.1 mol/L，分别加入含乙酸酐10 % (v/v)的乙腈溶液，孵育1 h，进行封闭，并清洗。 五、羧基化磁珠的核酸修饰

1、将150 μL羧基化磁珠（10 mg/mL）用等体积 25mM MES，pH 6，反复清洗2次，磁分离。

2、加入30 μL用25 mM MES，pH 6稀释的氨基化探针（100 μmol/L）到洗过的磁珠中 (磁珠上探针的浓度为400 pm/mg)，混合均匀后室温下温和旋转孵育30 min。

3、立刻用冷的25 mM MES，pH 6溶解EDC（10 mg/ml）。 4、加入15 μL EDC 溶液 (0.15 mg)到磁珠中混合均匀。 5、再加入5 μL 25 mM MES，pH 6 至50 μL。 6、在4℃旋转孵育2 h或更长时间（过夜）。每20分钟摇匀一次

7、磁分离4 min后吸去上清。为了中和没有反应的活化羧酸基团，将磁珠孵育在150 μL，50 mM Tris，pH 7.4，15 min；用50 mM Tris + 0.1 % Tween-20清洗磁珠4次。PBS加0.1 %的BSA封闭磁珠。

8、最后在加入0.02 % (w/v)的叠氮化钠(NaN3)，起到抑菌的作用。4度保存。 9、如果储存时间超过2周，用时需用PBS+BSA清洗5 min。

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六、O157特异基因的检测

1、Biotin标记O157特异序列的获取

2、 取30 μL探针修饰磁珠（10 mg/ml）磁分离后吸去上清，在30 μL反应体系中分别加入的杂交液（Invitrogen, USA）10 μL、ddH2O 18.5 μL和不对称PCR产物1.5 μL，混匀后在热盖温度为102 ℃的PCR仪中95 ℃变性10 min，50 ℃杂交1 h，每20 min混匀一次。 3、经60 μL 2×SSC-0.1% SDS、0.1×SSC-0.1 % SDS 和洗涤液（50 mM Tris，pH 7.5，0.15 M NaCl）各振荡、清洗3 min（提前将上述清洗试剂放在45 ℃的孵育器中，SDS温度低于42 ℃会析出！），最后磁分离吸去上清。

4、加入60 μL封闭液（洗涤液+0.25 % BSA+0.1 % Tween 20）混匀后室温放置30 min，期间不断混匀。

5、磁分离后吸去上清，加入1:4000酶稀释液（封闭液稀释的碱性磷酸酶标记的链亲和素）30 μL，混匀后室温孵育30 min。

6、磁分离后加入60 μL洗涤液用枪头吹打30次，轻轻吸出后转移至新的0.5 mL离心管中，磁分离后吸去上清，再加入洗涤液吹打清洗2次吸去上清液。

7、加入0.25 mM的AMPPD（0.1M Tris-HCl缓冲液溶解，1 mM MgCl2）300 μL。充分混匀后，分别取100 μL于白色微孔板的一个孔中，测定40分钟内的化学发光强度时间曲线。