猪血红蛋白的提取纯化与鉴定

系别：生命科学与技术学院

专业：生物科学

班级：生物科学0701

姓名：李嘉、潘婷婷

血红蛋白(Hemoglobin , Hb)是动物血液中的一种由4个亚基组成的多亚基蛋白质。作为体内氧运输的载体具有重要的生理功能。在 Hb 与氧结合及释放过程中 ,体现了别构蛋白各亚基之间相互作用的正协同效应特征 ,具有很强的代表性 ,是研究别构蛋白特性的良好材料。此外 ,Hb 的单亚基结构还与食用肉主要色素蛋白-肌红蛋白(Myoglobin , Mb)的结构非常相似 ,均为血红素蛋白质,具有一个血红素活性中心。只是 Mb 是单亚基结构 ,而 Hb为4亚基结构,相当于Mb的4倍体。Hb和Mb均具有3种天然诱导体构型 ,即氧合型 (Oxy-Hb ; Oxy-Mb) ,还原型(Red-Hb ; Red-Mb)和氧化型(Met-Hb; Met-Mb) 。两种蛋白质的相同构型均具有相同的颜色及相似的光谱学特性。

为此 ,也有人用 Hb 作为成本昂贵的 Mb 的代用品来研究食用肉色调变化的规律性。而目前市售的Hb多采用冷冻干燥法制备 ,多为Met-Hb 构型,其纯度较低 ,氧合活性较差 ,且该产品不能进行诱导体构型转化的调制 ,因而不能满足人们对食用肉色调变化进行研究的要求。

用丰富而廉价动物血液为原料，通过简便生产工艺制备Hb结晶（该结晶属氧化型）可进行多种诱导体形态的调制 ,调制出的各种诱导体具有类似于天然 Hb 的氧合功能特性 ,保持了别构蛋白与底物结合的正协同效应特点 ,同时 ,具有与天然诱导体形态相同的色调变化规律和光谱学特征。因此 ,可以满足人们进行别构蛋白及食肉色调研究的需求。此结晶具有稳定的理化性质 ,可长期保存。

一、教学目的

通过血红蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。有利于培养学生的学习兴趣。

二、实验方案

抗凝血100ml红细胞粗提液盐析透析离子交换凝胶过滤血红蛋白结晶II血红蛋白结晶II 图1 血红蛋白的提取纯化工艺流程图

1、动物血液的收集与处理

①取动物血液80-100ml，按 1：1 加入抗凝剂肝素（1250U/mL）混匀备用。

②将抗凝血液分装在4支50ml离心管中，3000 r/min ，4℃，离心10 min，弃去上清 ,收集红血球。

③向压积红细胞中加3-5倍量预冷的生理盐水，轻轻搅匀洗涤，3000 r/min ，4℃，离心10 min，吸出上清液弃去。再用生理盐水如上洗涤3次、最后吸出上清液弃去，收集红血球。

2、红细胞的破碎和血红蛋白原液的制备

方法一：将洗涤后的红细胞加2倍量的纯水 ,置4℃冰箱中过夜 ,使其自然溶胀破碎，10000 r/min ，4℃，离心20min，收集上层血红蛋白溶液（血红蛋白粗提液）。

方法二：将洗涤后的红细胞加2倍量的纯水 ,置-20℃冰箱中冰冻过夜 , 次日将冰冻红细胞放置室温或37℃水浴使之融化，摇匀，10000 r/min ，4℃，离心20min，收集上层血红蛋白溶液（血红蛋白粗提液）。

方法三：将洗涤后的红细胞加2倍量的纯水 ,超声波破碎，破碎条件：功率500W，能量80%，室温，开3秒停2秒，破碎时间30秒～X秒（180秒）。10000 r/min ，4℃，离心20min，收集上层血红蛋白溶液（血红蛋白粗提液）。

【取5mL血红蛋白粗提液留作血红蛋白含量测定和纯度分析】

3、盐析沉淀

取50ml血红蛋白粗提液制作盐析曲线，剩余部分（准确量体积）用于血红蛋白的盐析制备。

（1）血红蛋白盐析曲线的制作（需要粗酶液40～50 ml） a.取7支干净试管编号1～7，分别加入粗酶液5 ml；

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【取5mL血红蛋白粗提液留作血红蛋白含量测定和纯度分析】

5、纯度鉴定

三、结果与讨论

1、蛋白质标准曲线 2、血红蛋白盐析曲线

3、Sephadex G-100柱层析图谱

4、各步提纯结果（分离纯化进程结果比较表） 纯化步骤 总蛋白质mg 血红蛋白mg 血红蛋白粗提液 硫酸铵沉淀 血红蛋白粗结晶 凝胶色谱 5、聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

参考文献

相对纯度 纯化倍数 1.0