中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(12):89~93

Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展

张 雪

1,2

*

温廷益

2**

(1天津科技大学生物工程学院 天津 300457 2中国科学院微生物研究所 北京 100101)

摘要 Red重组作为一种新的重组系统已经被广泛用于大肠杆菌的基因敲除、基因替换。与传统的Rec重组相比,Red重组具有同源臂短,重组效率高等优点。分别详细介绍了Red重组系统中Exo、Beta、Gam3种蛋白质的功能,Red重组系统运用于大肠杆菌基因敲除的3种质粒及其功能,同时概括了Red重组的技术要点及技术难点,分析了文献报道的阿拉伯糖诱导浓度和诱导时间、转化后的复苏温度及时间、引物同源臂长度对于重组率的影响,总结出了Red重组的最佳条件。关键词 Red重组 大肠杆菌 基因敲除 同源臂 L-阿拉伯糖

中图分类号 Q819

同源重组作为体内基因工程的新方法使DNA修饰变得更容易、更有效,它是功能基因组分析的高效方法,可以在没有限制性内切酶和DNA连接酶的情况下实现DNA修饰

[1]

的末端,从5!向3!降解DNA单链,产生3!末端单链悬突(3!single_strandDNAoverhangs)

[3]

[Carter等

(1971)]。Beta作为单链退火蛋白,结合在由核酸外切酶(Exo)外切产生的3!末端单链悬突上,促进DNA互补链的退火

[4~6]

。

传统同源重组方法是利用RecA重组系统,但是以RecA同源重组为基础的基因敲除有很大的不足,如需要较长的靶基因同源臂,重组率很低,很难获得所需要的重组子等。

1998年,Murphy首次报道了利用 噬菌体Red

[2]

。Gam蛋白作为Exo、Beta的辅助蛋

[7]

白,可与RecBCD核酸外切酶结合,抑制RecBCD核酸外切酶活性,抑制体内的外源DNA的降解

。

RecBCD是高度ATP依赖的双链DNA核酸外切酶,在大肠杆菌中用于基因的同源重组和DNA复制叉的修复。研究表明,Gam蛋白对于反应进行中的RecBCD双链DNA核酸外切酶的抑制作用很小。事实上,Gam蛋白并不能抑制一个正在进行的反应,而是在ATP的存在下分离连在双链DNA末端的RecBCD。

[8]

重组系统在大肠杆菌染色体上进行基因替换的方法,将 噬菌体的重组功能基因exo,bet,gam在多拷贝质粒上表达,用于野生型E.coli宿主菌的基因替换。近年来,Red重组以其较短的同源臂和较高的重组效率等优点广泛用于大肠杆菌的基因修饰中。

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Red重组系统在大肠杆菌等一系列基因工程菌的基因修饰中发挥了重大的作用。本文将从Red重组的作用机理,相关质粒,技术方法及国内外研究应用等方面进行讨论。

2 Red同源重组相关质粒的介绍

Red重组系统共需要3种质粒:一种质粒是同源重组辅助质粒,其提供协助同源重组的exo、bet、gam3个基因,用于表达重组系统的3个蛋白;另一种质粒含有两侧带有翻转酶结合位点(flipaserecognitiontarge,tFRT)的抗性基因,用作PCR模板;最后一种质粒为抗性基因消除质粒,其含有重组酶,用于消除染色体上同源重组的抗性基因。本文将介绍几种最常用的相关质粒。

2.1 同源重组辅助性质粒pKD46、pRedET

46敏的制起ori,1 Red同源重组的作用机理

Red同源重组由 噬菌体的exo,bet,gam3个基因组成,分别编码Exo、Beta、Gam3种蛋白质。

Exo作为双链核酸外切酶,可以结合在双链DNA

收稿日期:2008 06 25 修回日期:2008 08 22*国家 863 计划(2006AA02Z216)资助项目**通讯作者,电子信箱:wenty@