抗Stat3多克隆抗体的制备和其在乳腺癌诊断中的应用(一) 作者：李宏芬，单保恩，陈晶，董青，王晓玲，王永军，陈兴，董金琢，马洪

【关键词】信号转导与转录激活因子3；抗体；乳腺肿瘤；组织学分级 PreparationofpolyclonalantibodyagainstStat3anditsapplicationinthediagnosisofbreastcancer 【

Abstract

】

AIM:TopreparerabbitantibodyagainstStat3andanalyzeitsapplicationinthediagnosisofbreastcancer.METHODS:ThemalerabbitswereimmunizedwithrecombinantmouseStat3proteintoprepareantibodyagainstStat3.ThepurityandspecificityoftheantibodywereanalyzedbyWesternBlot.TheexpressionofStat3proteininthe65casesofbreastcancerand30casesofnormalbreasttissuewasdetectedbyimmunohistochemicalstaining.RESULTS:ThetiterofantiStat3antibodyinserumwas>1∶256000(A450=0.40)atthe6thweekaftertheimmunization.BothSDSPAGEandWesternBlotanalysisshowedthattherewasanobviousproteinbandwithMr92000,TheintracytoplasmicexpressionlevelsofStat3proteininthedifferenthistologicalgradingsof65casesofbreastcancershowedsignificantdifference(P0.05),sodidtheintranuclearexpressionlevels(P0.05).CONCLUSION:PolyclonalantibodyagainstStat3withhightiterandspecificitycanbepreparedsuccessfully,anditcanbeusedtodetecttheexpressionofStat3proteininbreastcancertissue.

【Keywords】Stat3;antibodies;breastneoplasms;histologicalgrading 【摘要】目的：制备兔抗信号转导与转录激活因子3（Stat3）抗体，分析其在乳腺癌诊断中的价值.方法：应用人工重组小鼠Stat3蛋白，免疫雄性家兔制备抗Stat3抗体；用免疫印迹法分析检测抗Stat3抗体的纯度和特异性；应用免疫组化染色法检测65例乳腺癌和30例正常乳腺组织中Stat3蛋白的表达.结果：用Stat3蛋白免疫家兔被免疫6wk后，其血清中抗Stat3抗体效价>1∶256,000（A450nm=0.40）；SDSPAGE和免疫印迹分析均在分子质量（Mr）92000处有明显的带；65例乳腺癌组织的细胞浆和细胞核中，Stat3蛋白表达量在不同的组织学分级之间有统计学差异(P0.05).结论：高效价和特异性强的抗Stat3抗体被成功制备.该抗体可用于乳腺癌组织细胞Stat3蛋白表达的检测.

【关键词】信号转导与转录激活因子3；抗体；乳腺肿瘤；组织学分级 0引言 信

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异常的信号转导使Stat3磷酸化而被持续激活，促进细胞的恶性转化〔1〕和阻断细胞凋亡〔2〕.Stat3也可以被多种细胞因子、生长因子、非受体酪氨酸激酶、G蛋白等分子激活，将细胞外信号转导至细胞核，激活基因的转录和表达〔3〕.Stat3表达的变化与肿瘤的发生密切相关，

然而，有关Stat3在乳腺癌诊断中的作用还没有详细报道.我们用本室制备的小鼠重组Stat3蛋白，再制备兔抗Stat3抗体，来分析Stat3蛋白在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达，以及在乳腺癌诊断中的价值. 1材料和方法

1.1材料雄性，新西兰兔，体质量3.0kg(河北医科大学动物中心).福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂为美国GibcoRBL产品.HRP标记的羊抗兔IgG和免疫组化显色试剂盒（购自北京中山生物工程公司）.重组小鼠Stat3蛋白由本室和美国MD公司共同制备（蛋白含量1.63g/L，经SDSPAGE分离显示单一条带，Mr为92000）.30例正常乳腺组织来自良性增生和良性腺病的患者，65例乳腺癌组织来自女性乳腺癌患者，年龄(48±15)岁.这些研究对象经冰冻切片和免疫组化同时证实确诊，病理学分级由病理科提供，常规方法做病理切片.1.2方法

1.2.1免疫动物将Stat3蛋白（0.336g/L）0.2mL与福氏完全佐剂0.5mL混匀后，注射于家兔腹股沟和后脚掌进行初次免疫.14d将同样量的Stat3蛋白与福氏不完全佐剂0.5mL混匀后进行第二次免疫，注射部位同前.28d取Stat3蛋白（0.25g/L）0.15mL用福氏不完全佐剂0.5mL混匀后，于背部皮下多点注射进行最终免疫.42d处死兔子收集全血.其中于初次免疫前取耳静脉血2mL；第1次免疫后12d，第2次免疫后7d，第3次免疫后9,14d分别抽血3mL用于抗体效价测定.1.2.2抗体效价的检测用0.05mol/LpH9.5CBS稀释Stat3蛋白，用常规方法包被酶标板，ELISA法检测兔血清中抗Stat3抗体的效价.1.2.3抗体的纯化用330g/L

饱和硫酸胺盐析抗血清，离心沉淀后，用生理盐水透析24h，8h换1次生理盐水，将透析液用DEAE32层析柱进行浓缩，收集洗脱液，测A280nm值.

1.2.4抗体纯度和特异性检测将Stat3蛋白进行SDSPAGE分离（分离胶浓度为120g/L）.电泳后，用考马斯亮蓝R250染液染色确认蛋白条带，将分离胶中的蛋白用电泳转移法转移至PVDF膜，PVDF膜用50g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜.洗膜后，与兔抗Stat3抗血清(1∶1000稀释)37℃反应2h；加入HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5000稀释)，于37℃反应1h，以DAB显色.1.2.5乳腺组织细胞Stat3表达的检测200309/200403取本院外科65例乳腺癌患者手术切除的乳腺癌组织标本，30例良性增生和良性腺病的乳腺组织进行组织切片.将上述方法制备的兔抗Stat3抗体用PBS做1∶400稀释，按常规SP方法进行乳腺组织免疫组化染色.结果判断标准：按照Laird标准〔4〕进行，Stat3阳性表达为细胞质呈棕黄色云雾状，细胞核呈棕色颗粒状.每个视野中阳性细胞>50%为强阳性（），5%～50%的为阳性（+），5%为阴性（-）.Stat3蛋白胞质表达：细胞质呈深棕色云雾状>80%（），细胞质呈棕色云雾状>50%（），细胞质呈棕黄色云雾状>5%～50%（+），细胞质呈淡棕黄色云雾状5%（-）.Stat3蛋白胞核表达：细胞核呈深棕色颗粒状>80%（），细胞核呈棕色颗粒状>50%（），细胞核呈棕黄色颗粒状>5%～50%（+），细胞核不染色或呈淡棕黄色颗粒状5%（-）.统计学处理：免疫组化染色所得结果用SPSS11.5软件分析，统计方法为非参数秩和检验，Spearmans等级相

关.P0.05为有统计学意义.