BioTek应用手册

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药物筛选

一种常见的GPCR传感器-ERK1/2的自动均相磷酸化检测 -均相LanthaScreen®细胞分析

Paul Held and Peter Banks, BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT

Kristin Huwiler, Matthew Robers, and Bonnie Hanson, Life Technologies, Madison, WI

关键词：GPCR, LanthaScreen, ERK，TR-FRET

GPCRs的激活会刺激活化各种信号通路，大部分信号通路的激活均可能导致细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化。因此，针对ERK1/2的磷酸化检测可以代替GPCRs的活性检测。本文介绍了一种将BacMam调节的GFP-ERK2 传感器基因传递技术和LanthaScreen®细胞学实验技术相结合的时间分辨荧光共振能量转移技术（TR-FRET），该技术用来检测ERK2细胞外的磷酸化水平。上述技术的结合使检测任何感兴趣细胞的GPCRs活性变的更为灵活和可行。本文所介绍的是一种均相的，可以和自动化技术整合的实验方法。介绍

G蛋白偶联受体超家族作为药物靶点成员代表着现代医学的核心，大部分畅销药和约40%处方药都是以其作为药靶。受体酪氨酸激酶细胞膜受体(RTK)和G蛋白偶联受体(GPCR)通过几种不同的信号通路调节从细胞膜到细胞核的胞外信号。信号被传递，根据信号强度和持续时间不同诱导出不同的细胞反应。细胞外调节蛋白激酶(ERK)介导细胞表面受体通过不同的信号通路传递细胞增殖及分化的信号，被视为是一个关键的调节因子。(图 1)

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图1 GPCR 介导的MAPK/ERK1/2活化。

配体结合可以通过多种机制导致ERK1/2的磷酸化。与受体酪氨酸激酶的结合可以诱导停靠蛋白的募集。Ras蛋白被激活，导致RAF激酶的激活，从而诱导了MEK1/2 和 ERK1/2的磷酸化级联反应。

MAPK/ERK通路也可以被GPCR的激动剂所激活。这些机制涉及到第二信使依赖的蛋白激酶，β-Actin的富集，或受体酪氨酸激酶的转录激活。ERK1/2的磷酸化激活可以做为G蛋白依赖及G蛋白不依赖的标记信号。然而，直到目前为止，一直缺少可以高通量检测ERK活性的技术。我们推出了一种BacMam ERK1/2细胞学分析方法，该方法将BacMam介导的GFP-ERK2 传感器基因传递分析法和LanthaScreen®细胞学实验技术结合起，来检测胞外的ERK1/2的磷酸化水平。BacMam病毒是一种被修饰的杆状病毒载体。杆状病毒是一种昆虫细胞病毒，对哺乳动物细胞没有毒害，而且不会在哺乳动物细胞内进行复制。该病毒载体包含一个CMV表达调控元件，可以维持约5天高水平的瞬时表达。此外，该病毒可以允许大片段的插入(达38kb)，并转染到原代细胞株和干细胞株。(图 2)

图2 BacMam 病毒

BacMam ERK1/2细胞实验使用BacMam ERK2病毒转染

干细胞，导致了GFP-ERK2融合蛋白的表达。(图 3A)当表达GFP-ERK2细胞受到刺激，ERK被磷酸化，细胞开始溶解，铽（Tb）标记的检测抗体结合到ERK2的双磷酸化位点Thr185,Tyr187。从而在Tb和GFP之间产生了荧光能量的转移，产生了TR-FRET信号。(图 3B)

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